Holmes hẹn hò với ngôi sao Joshua Jackson, bạn diễn cùng cô trong Dawson's Creek. Cô gặp diễn viên Chris Klein năm 2000. Klein và Holmes đã tham gia vào cuối năm 2003, nhưng vào đầu năm 2005, cô và Klein đã chấm dứt mối quan hệ của họ. Klein và Holmes vẫn là những người bạn ở mức độ khác nhau kể từ khi tan vỡ.

Chỉ một vài tuần sau khi mối quan hệ của cô với Klein kết thúc, Holmes bắt đầu hẹn hò với diễn viên Tom Cruise vào tháng 4 năm 2005. Cô bắt đầu nghiên cứu về Scientology ngay sau khi cặp đôi bắt đầu hẹn hò. Họ đã kết hôn vào tháng 6 năm 2005. Họ có một cô con gái sinh năm 2006. Vào ngày 18 tháng 11 năm 2006, Holmes và Cruise đã kết hôn trong một buổi thảo luận về khoa học gia tại lâu đài Odescalchi thế kỷ XV ở Bracciano, Italy. Nhà báo của diễn viên cho biết đôi vợ chồng này đã "chính thức hoá" cuộc hôn nhân của họ ở Los Angeles vào ngày trước buổi lễ của Ý.

Vào ngày 29 tháng 6, Holmes đã nộp đơn xin ly hôn Tom Cruise ở New York sau 5 năm rưỡi cưới. Chỉ mười ngày sau khi Holmes nộp đơn xin ly dị, ngày 9 tháng 7 năm 2012, luật sư của hai vợ chồng tuyên bố rằng cặp đôi này đã ký một thỏa thuận chính thức ly hôn.